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治疗病毒性心肌炎新药心得康的研究开发 |
严永清
中 国 药 科 大 学
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病毒性心肌炎是心血管疾病中常见病之一，也是难治病之一，至今尚无良药。西药虽有干扰素、肿瘤坏死因子、白介素－II、三氮唑核苷、抗胸腺细胞抗体、免疫调节剂等用于治疗病毒性心肌炎，但效果均不理想，常有不同程度的不良反应，且价格昂贵。所以临床上大多采用ATP、辅酶Q、辅酶A、Vc等营养性能量制剂作为常规治疗。
生脉散是一个有817年历史的著名古方，最早记载于《医学启源》（金，公元1186年），我们曾在“六五”“七五”期间研究开发为口服液等剂型，用于气阴两虚的冠心病、心绞痛等症病的治疗，具有良效。近些年来，有10多家医院报道，用生脉散制剂（颗粒剂、注射剂、煎剂等）治疗病毒性心肌炎，均疗效肯定。
为了发扬中医药的优势，我们拟在过去研究生脉散10多年的基础上，研究开发治疗病毒性心肌炎的新药，使之成为对该病优于西药的中药二类新药。为此，我们加强了对生脉散方剂的基础研究，如在过去的研究中发现：人参、麦冬、五味子3药合煎液的药效、疗效优于分煎混合液；用红参优于生晒参；3药组成比例与药效有关等。通过对生脉散复方在煎煮过程中化学成分的动态变化与药效关系的研究，初步阐明了合煎液与分煎混合液中主要有效成分人参皂苷的组成不同，红参与生晒参间主成分的差异，揭示了3药组成的最佳比例等因素。为进一步确定和分离提取有效部位群，研制成二类新药心得康奠定了基础。
1. 生脉散复方中化学成分的动态变化与药效关系的研究
中药复方药效作用的物质基础是中药现代化的关键。长期以来国内外对中药的研究大多集中在单味药有效成分的筛选或复方的药效研究上，而对复方的化学及其有效部位的药效，进行深入研究尚不多见。我们以生脉散为对象，研究复方中各主要组分在混煎过程中产生的化学变化、变化条件与原理，从而阐明生脉散临床疗效的物质基础，以及复方优于单味药的原因，并从合煎药中提取分离3个有效部位，进行病毒性心肌炎模型的实验研究。
1.1 以HPLC－ELSD法研究人参皂苷的变化及机理
以HPLC－ELSD法分析人参皂苷的结果表明：人参与无味子合煎后，人参皂苷的含量大幅度降低，但3药合煎液总皂苷含量无明显降低，提示麦冬在合煎过程中对人参皂苷有保护作用，能对抗无味子酸性对人参皂苷的水解破坏。
生脉散全方中人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1均已消失，而Rg3、Rh1含量比单味人参中明显增高，在生脉散煎剂中Rg2、Rg3、Rh1、
Rf成为人参皂苷中的主要皂苷。
人参与麦冬配伍，人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1含量明显降低，而Rg2、Rg3、Rh1、 Rf含量则有显著升高，麦冬用量增大，上述皂苷的降低和升高量逐步增加；当人参和麦冬比例为1∶4时为限，继续增加麦冬用量则出现相反结果。
人参与无味子配伍，人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1均消失，而Rb3、Rh1含量增高，Rf则有所下降。在人参与无味子比例为1∶0.5～1∶2之间，随无味子用量的增加，Rg3含量逐步提高，Rh1含量也有所增加，Rg2的含量变化不甚规则，Rf变化较小。但当人参与无味子用量比例超过1∶2.5时，Rg3、Rh1含量反而有所下降。
以盐酸代替无味子进行煎煮，人参皂苷的变化结果与人参、无味子配伍情况一致，证明无味子的酸性是促使复方中人参皂苷发生转变的主要因素。
根据人参与麦冬配伍比例1∶3～4，人参与无味子配伍比例1∶0.5～2之间为最佳配伍比例，可以认定现用处方人参∶麦冬∶无味子＝1∶3∶1.5是最佳比例的组方。
1.2 以HPLC法研究生脉散中麦冬黄酮的配伍变化
以HPLC法考察麦冬中甲基麦冬黄烷酮A、B在正丁醇部位中的含量，结果表明：在生脉散及其不同配伍组中，麦冬甲基黄烷酮A、B的含量变化趋势是一致的。配伍后的样品中麦冬黄酮的含量远低于单味麦冬中的含量，麦冬与人参、无味子合煎过程中，无味子能降低麦冬黄酮的含量，而人参则能对抗这种作用。提示药物在共煎过程中存在相互作用，对有效成分的溶出具有或促进、增加，或抑制、降低，从而影响复方化学成分的最终含量。
1.3 以比色法、HPLC法研究生脉散中无味子木脂素的配伍变化
对无味子木脂素测定结果表明：无味子醇甲及总木脂素含量明显增高，说明人参和麦冬均有促使无味子木脂素溶出的作用。生脉散及其各配伍组正丁醇部位不含无味子甲素、乙素及无味子酯甲等木脂素成分；尚含有少量的无味子醇乙。因此复方生脉散中无味子木脂素类成分主要是无味子醇甲、醇乙。而据文献报道，无味子醇甲具有抗氧化和降低血清转氨酶等多种作用。
2. 由3个有效部位群组成的心得康对病毒性心肌炎动物的实验研究
在上述研究基础上，以柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3)(简称CVB3),Nancy株感染BABL/c小鼠建立病毒性心肌炎模型，并以此模型从合煎液分离有效部位，筛选确定了由A、B、C
3个有效部位的混合物组成心得康处方。
取BABL/c小鼠，体重12g左右，按体重随机分为正常组、模型组、ATP+CoQ10组、生脉散的SMT低剂量组、SMT中剂量组、SMT高剂量组，每组小鼠10只。正常组ip0.1ml生理盐水，其余各组小鼠ip0.5％/CMC－Na，ATP+CoQ10组小鼠ipATP（12mg/kg）＋CoQ10（12mg/kg）、SMT低、中、高剂量组小鼠分别ipSMT230mg/kg、920mg/kg，连续7天。于第4天和第8天将小鼠称重。于第8天，将小鼠摘除眼球取血，4°C、12000rpm离心5分钟，取血清，测定其中的心肌酶LDH（乳酸脱氢酶）、AST（谷草转氨酶）含量及SOD(超氧化物歧化酶)、MDA（丙二醛）水平。取出心脏，将心脏在4％多聚甲醇中固定，以供光镜检查，根据受损面积和受损程度将心肌心肌损害分为+～++++级。+：损伤累及范围＜25％；++：损伤累及范围25～50％；+++：损伤累及范围50～75％；++++：损伤累及范围＞75％。本实验重复3次。在第3次实验设一SMT正常组，即正常BABL/c小鼠ipSMT920mg/kg，连续7天，用于观察SMT对正常小鼠的影响。第3次实验中，在第8天各组小鼠中，随机取3只，无菌取出心脏，用生理盐水制成10％的组织匀浆，15000rpm离心5
min，吸取上清液，测定其中病毒滴度，并从心尖部取下一小块心肌组织，用2.5％戊二醛固定，用于电镜检查，其余心脏用4％多聚甲醇固定，用于光镜检查。其余小鼠同前操作。
感染病毒的小鼠在第3天出现疾病症状，表现体重增长减慢，毛蓬松，震颤，体温降低，有些小鼠后肢无力，瘫痪，并开始出现死亡情况。
对病毒性心肌炎动物的实验研究表明于5个方面：
2.1 小鼠感染病毒后，体重增长的速度明显减慢。在第4天，病毒性心肌炎小鼠体重明显低于正常组；小鼠给以ATP+CoQ10后，其体重的增长速度甚至低于模型组（P＜0.05）；小鼠给以SMT后，体重增长高于模型组，但没有显著差异（P＞0.05）。在第8天，SMT460mg/kg组，小鼠体重增长的速度高于模型组，且有显著差异(P＜0.05)。
2.2 小鼠感染病毒后，血清中LDH、AST含量显著提高。SMT460mg/kg和920mg/kg用药对血清中的心肌酶LDH、AST的升高，有显著的抑制作用（P＜0.05，P＜0.01）。
2.3 光镜病理检查结果为：
正常组：心肌纤维结构清楚，排列紧密，间质未见炎性细胞浸润，无明显病变。
模型组：心肌出现不同程度的变性坏死，心肌间隙增宽，血管扩张充血，炎性细胞呈灶性或散在分布（以淋巴细胞和单核细胞为主），心外膜处尤为明显，并可见组织细胞增生。
SMT低剂量组：心肌组织形态较模型组有所改善，表现为心肌变性坏死程度减轻，炎性细胞浸润减轻，水肿现象减轻。
SMT高剂量组：心肌形态学改变较低剂量组有所改善。
SMT中剂量组：心肌形态学改变介于低剂量组与高剂量组之间。
ATP+CoQ10组：心肌形态学接近低剂量组。
由此可见，SMT460mg/kg、920mg/kg用药可明显减轻病毒性心肌炎小鼠的心肌变性坏死、炎性细胞浸润和水肿的病理改变（P＜0.05，P＜0.01）。
电镜检查结果为：模型组中观察到广泛的病变区域。其特征是线粒体外膜破损，脊数量稀少，基质消失，极度肿胀；心肌纤维走向扭曲、溶解；局部出现空泡区。对照组、高剂量组、中剂量组和ATP+CoQ10组的特征是，线粒体形态完整，外膜、脊超微结构正常，基质丰富，偶见呈聚集态线粒体分布；心肌纤维走向规则，与对照组无明显差异。低剂量组中尚有部分病变分布，其结构特征与模型组相同，但总体病变程度较低。
2.4 病毒性心肌炎小鼠血清中SOD水平明显降低，MDA含量明显升高。SMT各剂量组对血清中SOD活力无明显的影响（P＞0.05），但都能非常显著地降低MDA含量（P＜0.01）。ATP和CoQ10也能显著降低血清中MDA含量（P＜0.05）。
2.5 SMT460mg/kg和920mg/kg用药可显著降低病毒性心肌炎心脏中病毒的滴度（P＜0.05）。
3. 结 论
SMTip460mg/kg用药，能显著促进病毒性心肌炎小鼠的体重增长（P＜0.05），表明该药 能增强感染病毒的小鼠的体质。SMTip460mg/kg、920mg/kg用药能降低病毒性心肌炎小鼠血清中心肌酶（LDH和AST）的含量（P＜0.05，P＜0.01），改善病毒所引起的心肌病理改变，并能改善心肌超微结构，说明该药对病毒导致的心肌损伤有保护作用。SMT各剂量组均能降低病毒性心肌炎小鼠血清中MDA的含量，说明该药可能通过降低体内自由基的作用，达到保护心脏。SMTip460mg/kg和920mg/kg用药能降低小鼠心脏匀浆中病毒滴度，说明该药能抑制病毒在心脏内的增殖。
此外，研究了心得康对动物实验性心肌缺血、心律失常、休克、心力衰竭及心脏血流动力学的影响，还就一般药理学规定的急性毒性、长期毒性作了研究，都证明心得康可能成为第一个由有效部位群组成的治疗病毒性心肌炎安全有效的中药二类新药。这一新型中药新药已于2002年7月获准临床试验，目前临床研究工作正在进行中。
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